Innovative bioremediation strategies for contaminated marine sediments

Marine sediments represent a sink for organic and inorganic contaminants, coming from industrial activity, air pollution, rivers, spills, sewage and other sources. Dredged sediments are often characterized by the presence of high organic and inorganic concentrations, influencing sediment re-use and/or disposal. Several kinds of treatments can be used to reduce the level of contamination, and among the available technologies the use of eco-compatible bioremediation strategies can be chosen, such as biostimulation of autochthonous microbial communities or bioaugmentation, introducing specific microbial strains. Microbial stimulation by means of nutrient addition is a common approach, able to enhance hydrocarbon biodegradation rate in marine sediments. Metals, which cannot be degraded, can only pass from one redox state to another, which influences their solubility. Bioremediation of inorganic contaminants can be aimed at a change in speciation and partitioning of metals, either increasing their solubility in water or increasing their stability in the sediment. It has also been observed that the application of strategies for sediment remediation can determine shifts in the composition of the prokaryotic community, with the selection of certain strains rather than others. This thesis deals with bioremediation of contaminated sediments, and the main questions addressed are: 1- Can treatments aimed at hydrocarbon degradation influence metal partitioning? 2- Is it possible to assess hydrocarbon degradation extent using simple kinetic models based on prokaryotic growth rates? 3- Is there a relationship between hydrocarbon degradation and bacterial biodiversity? 4- Which are the potential roles of the dominant prokaryotic phylotypes in hydrocarbon degradation and metal partitioning? Microcosm experiments were set up to answer these questions. In the first experiment, the focus was addressed to sediments contaminated with petroleum hydrocarbons and heavy metals. The hypothesis was that in microcosm experiments under anaerobic conditions submitted to biostimulation and bioagumentation strategies, an enhanced biodegradation of hydrocarbons modified the partitioning of heavy metals with potential consequences on their mobility and bioavailability. The bioremediation approach used in these experiments determined a significant decrease in hydrocarbon concentration, but also changes of the heavy metal partitioning. Another set of experiments was designed, and a semi-empirical kinetic model was successfully fitted to experimental temporal changes of hydrocarbon residual concentrations and microbial abundances, able to predict bioremediation performances. Such model, eventually adapted to biogeochemical characteristics that are site-specific, may be a useful tool when designing eco-compatible technologies for contaminated sediment remediation. Trying to better understand the effects due to sediment manipulation in laboratory trials, the changes in the bacterial community were studied in bioremediation experiments with contaminated marine sediments both under aerobic and anaerobic conditions. A positive correlation was found between bacterial biodiversity and hydrocarbon biodegradation performance both under aerobic and anaerobic conditions. Bioremediation extent could be enhanced by possible mutually facilitative interactions among microorganisms. Considering the importance of prokaryotic biodiversity for bioremediation purpose, a study was carried out to characterize the composition of the main prokaryotes involved in bioremediation of contaminated sediments under anaerobic conditions. From sequencing data of the dominant 16S rRNA genes on the sediment samples, it was found that most of the archaea that comprised the microbial community were affiliated to the phylum Euryarchaeota, in particular to the orders of Methanomicrobiales, Methanosarcinales, and Thermoplasmatales. Bacterial gene sequences belonged to the Alpha-, Gamma- and Deltaproteobacteria, Firmicutes, Chloroflexi, Actinobacteria, Bacteroidetes, and Verrucomicrobia. The results of this work suggested that in anoxic sediments specific bacterial taxa influence the extent of hydrocarbon degradation whereas archaea could be involved in changes of metal partitioning. This research activity has allowed not only to have a better understanding of the role of microbial communities in relation to contaminant fate for specific sediment samples, but also to develop a know-how useful when facing with sediment bioremediation. In fact, many difficulties might be encountered related to sample heterogeneity, trace concentration of contaminants and site-specificity. Therefore it is fundamental to use an interdisciplinary methodological approach, based on tools of microbial ecology, biogeochemistry and process analysis.

I sedimenti marini costituiscono un serbatoio per i contaminanti organici ed inorganici, provenienti da attività industriali, inquinamento atmosferico, fiumi, fuoriuscite accidentali, fognature ed altre fonti. I sedimenti di dragaggio sono spesso caratterizzati dalla presenza di elevate concentrazioni di contaminanti organici e inorganici, influenzando il ri-uso dei sedimenti e/o il loro smaltimento. Diversi tipi di trattamenti possono essere utilizzati per ridurre il livello di contaminazione, e tra le tecnologie disponibili, strategie eco-compatibili di biorisanamento possono essere scelte, come la biostimolazione di comunità microbiche autoctone o la bioaugmentazione, introducendo specifici ceppi microbici. La stimolazione microbica mediante aggiunta di nutrienti è un approccio comune, in grado di migliorare i tassi di biodegradazione di idrocarburi nei sedimenti marini. I metalli, che non possono essere degradati, possono passare da uno stato redox ad un altro, influenzando la loro solubilità. Il biorimedio di contaminanti inorganici può essere indirizzato al cambiamento di speciazione e ripartizione dei metalli, aumentando la loro solubilità in acqua o la loro stabilità nel sedimento. È stato inoltre osservato che l'applicazione di strategie per la bonifica dei sedimenti è in grado di determinare cambiamenti nella composizione della comunità procariote, con la selezione di alcuni ceppi piuttosto che altri. Questa tesi si occupa di biorisanamento di sedimenti contaminati, e le principali domande poste sono: 1- I trattamenti diretti alla degradazione di idrocarburi possono influenzare la ripartizione dei metalli? 2- È possibile valutare la performance di degradazione degli idrocarburi utilizzando semplici modelli cinetici basati sui tassi di crescita dei procarioti? 3- Esiste una relazione tra la degradazione degli idrocarburi e la biodiversità batterica? 4- Quali sono i potenziali ruoli dei filotipi procariotici dominanti nella degradazione di idrocarburi e nella ripartizione dei metalli? Esperimenti di microcosmo sono stati allestiti per rispondere a queste domande. Nel primo esperimento, l'attenzione è stata indirizzata a sedimenti contaminati da idrocarburi del petrolio e metalli pesanti. L'ipotesi era che in esperimenti di microcosmo in condizioni anaerobiche sottoposti a strategie di biostimolazione e bioagumentazione, una maggiore biodegradazione di idrocarburi modificasse la ripartizione dei metalli pesanti, con potenziali ripercussioni sulla la loro mobilità e biodisponibilità. L'approccio di bioremedio utilizzato in questi esperimenti ha determinato una diminuzione significativa della concentrazione di idrocarburi, ma anche cambiamenti della ripartizione dei metalli pesanti. È stata affettuata un'altra serie di esperimenti, e un modello cinetico semi-empirico è stato applicato con successo ai dati sperimentali delle variazioni temporali delle concentrazioni residue di idrocarburi e alle abbondanze microbiche, in grado di prevedere le prestazioni del biorisanamento. Tale modello, eventualmente adattato alle caratteristiche biogeochimiche sito-specifiche del sito, può essere uno strumento utile nella progettazione di tecnologie eco-compatibili per la bonifica di sedimenti contaminati. Cercando di capire meglio gli effetti dovuti alla manipolazione dei sedimenti in prove di laboratorio, sono stati studiati i cambiamenti nella comunità batterica in esperimenti di biorisanamento con sedimenti marini contaminati, sia in condizioni aerobiche sia anaerobiche. Una correlazione positiva è stata trovata tra la biodiversità batterica e l’efficacia di biodegradazione degli idrocarburi, sia in condizioni aerobiche sia anaerobiche. L’efficacia del biorimedio potrebbe essere stata aumentata da possibili interazioni facilitative tra microrganismi. Considerando l'importanza della biodiversità procariotica ai fini del biorimedio, è stato effettuato uno studio per determinare la composizione dei principali procarioti coinvolti nel biorisanamento di sedimenti contaminati in condizioni anaerobiche. Dai dati del sequenziamento dei dominanti geni che codificano per il 16S rRNA, si è riscontrato che la maggior parte degli archaea che componevano la comunità microbica era affiliata al phylum degli Euryarchaeota, in particolare agli ordini del Methanomicrobiales, Methanosarcinales e Thermoplasmatales. Le sequenze geniche batteriche appartenevano agli Alpha-, Gamma- e Deltaproteobacteria, Firmicutes, Chloroflexi, Actinobacteria, Bacteroidetes e Verrucomicrobia. I risultati di questo lavoro suggeriscono che nei sedimenti anossici specifici taxa batterici influenzano l’efficacia di degradazione degli idrocarburi mentre gli archaea potrebbero essere coinvolti nei cambiamenti di ripartizione dei metalli. Questa attività di ricerca ha permesso non solo di avere una migliore comprensione del ruolo delle comunità microbiche in relazione al destino dei contaminanti per i campioni di sedimento specifiche, ma anche di acquisire conoscenze e competenze utili nel campo del biorimedio di sedimenti contaminati. Infatti, si possono incontrare molte difficoltà legate all’eterogeneità del campione, concentrazione in traccia dei contaminanti, differenze sitospecifiche. Quindi risulta fondamentale l’utilizzo di un approccio metodologico interdisciplinare, basato su strumenti di ecologia microbica, biogeochimica e analisi di processo.