Ibridazione in situ in fluorescenza: localizzazione di fitoplasmi in cicaline infette catturate in vigneti marchigiani

I fitoplasmi sono un ampio gruppo di parassiti obbligati intracellulari appartenenti alla classe dei Mollicutes. Associati a molte malattie delle piante, si diffondono in natura grazie ad insetti Omotteri, che si nutrono a spese del tessuto criboso (floemomize), appartenenti principalmente alle famiglie Cicadellidae, Cixiidae (cicaline) e Psillidae. L’insetto nutrendosi da pianta infetta acquisisce il fitoplasma che passando dal canale alimentare per via emolinfatica invade diversi organi ma ne diventa il vettore in seguito all’invasione delle ghiandole salivari; in questo caso il fitoplasma può essere trasmesso a piante sane attraverso la secrezione salivare. Lo studio della localizzazione del fitoplasma all’interno dell’insetto è un utile approccio capace di ampliare le conoscenze relative all’interazione insetto-fitoplasma, risultato della relazione filogenetica tra i due organismi, capace di influenzare fitness dell’insetto e capacità di trasmissione del patogeno. In particolare l’analisi dell’infezione naturale da fitoplasmi in insetti catturati in campo può fornire informazioni utili a chiarire questi aspetti. L’obiettivo della ricerca è stato quello di condurre uno studio sulla localizzazione di fitoplasmi a livello di organi/tessuti in esemplari naturalmente infetti di Hyalesthes obsoletus Signoret (Cixiidae) ed Euscelis lineolatus Brullé (Cicadellidae) campionati in vigneti affetti da fitoplasmosi, della regione Marche. Con tale finalità è stato applicato un approccio analitico utilizzando l’ibridazione in situ in fluorescenza (FISH). Saggi preliminari di inoculazione su substrato sintetico e analisi PCR hanno individuato insetti sani o infetti da fitoplasmi. H. obsoletus è risultato infetto da “Candidatus Phytoplasma solani” (gruppo stolbur sottogruppo 16SrXII-A) mentre E. lineolatus è risultato infetto dai sottogruppi 16SrI-B; I-C associati a “Ca. Phytoplasma asteris” e 16SrXII-A. L’analisi FISH è stata condotta utilizzando una sonda fluorescente, marcata con fluoresceina isotiocianato (FITC), relativa al gene tuf (fattore di allungamento Tu=Ef-Tu) omologa a fitoplasmi appartenenti ai gruppi 16SrI e 16SrXII-A identificati negli insetti. L’intensità e la specificità di ibridazione sono state incrementate grazie all’inserimento nella sonda di basi modificate, acidi nucleici “locked” (LNA). Lo studio ha rivelato segnali d’ibridazione negli insetti infetti da fitoplasmi mentre nessun segnale specifico è stato individuato in insetti sani mostrando la possibilità di applicare la tecnologia FISH in insetti affetti naturalmente dal patogeno